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新型冠状病毒的实验室检测│临床必备

新型冠状病毒的实验室检测│临床必备

自2019年底,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的肺炎疫情迅速传播,给人民的生命安全和身体健康造成了严重危害。

截止2020年3月8日,全国累计确诊人数80868例。

目前国际上疫情形势不容乐观,国内各行业也处于待复工复课阶段,所以做好防疫工作仍然是我们当前的艰巨任务。

作者:李静 北京大学国际医院检验科

本文为作者授权医脉通发布,未经授权请勿转载。

在疫情发生后,我国的生物医学工作者迅速分离了SARS-CoV-2病毒,做了病毒基因序列分析,研发出了许多SARS-CoV-2的检测试剂盒。经国家药品监督管理局快速审批后,试剂迅速运抵一线,在新型冠状病毒肺炎的诊断中发挥了重要作用。目前,还有很多不同试剂在研发和等待审批阶段,我们就已有的检测方法做一个简单总结讨论。

目前新型冠状病毒的诊断标准是根据国家卫生健康委2020年3月3日最新公布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[1]

疑似病例

结合下述流行病学史和临床表现综合分析:

1. 流行病学史

(1)发病前14天内有武汉市及周边地区,或者有其他病例报告社区的旅行史或居住史;

(2)发病前14天内与新型冠状病毒感染者(核酸检测阳性者)有接触史;

(3)发病前14天内曾接触过来自武汉市及周边地区,或来自有病例报告社区的发热或有呼吸道症状的患者;

(4)聚集性发病(2周内在小范围如家庭、办公室、学校班级等场所,出现2例及以上发热和/或呼吸道症状的病例)。

2. 临床表现

(1)发热和/或呼吸道症状;

(2)具有新型冠状病毒肺炎影像学特征;

(3)发病早期白细胞总数正常或降低,淋巴细胞计数正常或减少。

有流行病学史中的任何一条,且符合临床表现中的任意2条。无流行病学史的,符合临床表现中的3条。

确诊病例

疑似病例同时具备以下病原学或血清学证据之一者:

1. 实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性;

2. 病毒基因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源;

3. 血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性;血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。

新冠病毒各种检测方法

根据上述诊断标准,确诊病例仍然需要具备病原学或者血清学的证据,因此对各种检测方法有足够认识,才能更好地辅助临床诊断。

1. 病毒基因的测序

由于耗时较长且费用较高,不适用于大样本量的临床诊断。

2. SARS-CoV-2病毒的核酸检测

目前许多厂商都积极研发了试剂盒,并投入使用,但核酸检测的结果容易受到多种因素影响。这其中涉及到样本采集与存放,病毒感染的部位,RNA提取方法,核酸检测试剂盒质量问题等多方面因素,给新冠感染诊断及防疫防控带来巨大的影响。多家实验室都出现了核酸检测假阴性的情况,从而导致核酸检测结果与临床症状、影像学检查不相符。

目前SARS-CoV-2核酸检测结果假阴性有多种原因,包括标本质量不合格,标本收集的过早或过晚,没有正确的保存、运输和处理标本,以及技术本身存在的原因如病毒变异等。[2][3] 首先,考虑到初期疫情传播迅速,试剂盒的研发任务紧急,针对这种情况,建议核酸检测试剂盒能增加检测灵敏度和特异度的临床验证,而且一定要有内参的合理设计和使用。此外,因为分泌物和灌洗液等标本的病毒拷贝数可能较少,因此在保证检测性能的情况下尽可能降低检出限并扩大适用的样本类型是临床的迫切需求。最后,希望实验室人员能够协助临床规范样本的采集和保存过程,尽可能减少试验的分析前误差。

3.血清学抗体检测

新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[1]里关于新冠肺炎的诊断最主要的修订就是添加了SARS-CoV-2病毒血清学抗体的检测作为疑似病例确诊的证据之一。

抗体(antibody, Ab)是由抗原刺激产生并能与对应抗原特异结合的、具有免疫功能的糖蛋白。抗体可分为五类:IgM、IgG、IgA、IgE和IgD,最常见的功能是中和毒素和阻止病原体入侵。病毒感染机体后,免疫系统对病毒进行免疫防御并产生特异性抗体。其中临床主要检测的是IgM和IgG抗体。SARS-CoV-2的IgM抗体多在发病3-5天后开始出现阳性,可提示近期感染。IgG抗体是再次免疫应答产生的主要抗体,通常提示病情进入恢复期或存在既往感染。现行的诊断新冠肺炎的血清学证据要求,血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性,或者血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。[1]

目前,临床使用的抗体检测方法主要有酶联免疫法、化学发光法以及胶体金法。酶联免疫法和化学发光法都可以进行定量检测,是抗体检测的主要方法。有研究报道,化学发光法检测血清SARS-CoV-2 IgM和SARS-CoV-2 IgG的临床敏感度分别为70.24%和96.10%,临床特异度分别为96.20%和92.41%。SARS-CoV-2抗体检测的阳性预测值为95.63%,阴性预测值为91.03%。[4]胶体金法则是一种即时检测(point- of-care testing,POCT)方法,具有快速出具结果、检测场地不受限制以及对操作者要求低的优点。但是,胶体金法只能进行定性检测,作为POCT检测方法,主要目的是快速且相对准确地检验。因此,对比抗体的定量检测方法,灵敏度和特异度相对欠佳。

值得注意的是,不管抗体的定性检测还是定量检测,检测结果同样会有假阴性和假阳性的情况出现。个别患者血液中含有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体,以及药物和肿瘤细胞等,易造成试验的交叉反应,故偶现假阳性的结果。因此,建议临床医生结合患者的流行病学史,临床表现,新冠肺炎影像学特征及实验室检测结果进行综合判断及评估。

表1 新型冠状病毒血清抗体的检测结果解读

IgM

IgG

结果判读

+

1. 提示早期感染

2. 不能排除假阳性可能(特别是低流行地区)

+

+

提示现症感染

+

1. 提示感染,但不能区分现症感染还是既往感染

2. 定量检测IgG双份血清由阴转阳,或恢复期较急性期升高4倍及以上可回顾性诊断

3. 不能排除假阳性可能

1. 未感染

2. 窗口期

3. 不能排除假阴性可能

截止目前,生物医学工作者仍然在不懈努力,研发新的检测方法,例如已有报道的流式免疫层析法和恒温扩增芯片法等。随着疫情防控工作进入关键阶段,医务人员对新冠的认识不断深入以及临床和实验室之间的有效沟通,能够有助于合理选用多种检测手段,不断地提高诊断效率和准确性,从而构建起有效的监控检测体系。

参考文献

[1]中华人民共和国国家卫生健康委员会. 关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)的通知(国卫办医函〔2020〕184号)[EB/OL].(2020-03-03).https://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-03/04/content_5486705.htm

[2]里进,叶光明,陈良君,等. 新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测假阴性结果原因分析及对策[J].中华检验医学杂志,2020,43(00):E006-E006.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158. 2010.03.000.

[3]莫茜,秦炜,傅启华,等. 正确认识新冠病毒核酸检测的影响因素[J]. 中华检验医学杂,2020,43(00): E002-E002.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-8158.2020.03.002.

[4]徐万洲,李娟,何晓云等.血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值.[J]中华检验医学杂志, 2020,43. DOI:10.3760/cma.j.cn114452-20200223-00109

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